ALLERGENI RICOMBINANTI:UTILIZZO NELLA PRATICA CLINICA

INTRODUZIONE

Le allergie sono divute ad un' anomala reattività dell'organismo verso sostanze riconosciute estranee (allergeni) dai soggetti ad esse sensibili (allergici).
Le allergie sono responsabili di manifestazioni cliniche quali: rinite, congiuntivite, asma bronchiale, orticaria, shock anafilattico ecc.

Allergeni

Gli allergeni sono, per definizione, antigeni che riconosciuti dal soggetto allergico come "estranei" al proprio organismo, provocano, nello stesso, una risposta immunitaria con formazione di anticorpi IgE, detti anticorpi anafilattici o reagine, sono responsabili delle manifestazioni cliniche.

Gli allergeni sono numerosi e possono essere classificati in:

  • Allergeni da inalazione: pollini, dermatofagoidi funghi ed (altri parassiti) presenti nelle polveri ambientali, che nella maggior parte dei casi sono responsabili di manifestazioni come riniti allergiche e asma bronchiale.
  • Allergeni da ingestione: alimenti di origine animale o vegetale, farmaci che possono provocare manifestazioni sia a carico della cute e delle mucose (sindrome orticaria-angioedema), sindrome orale, sia gastrointestinali, respiratorie e dare quindi una sindrome sistemica (shock anafilattico).
  • Allergeni da puntura: farmaci e veleni di insetti, soprattutto da Imenotteri (api, vespe, calabroni) che possono dar luogo a reazioni locali e sistemiche come shock  anafilattico.

Diagnosi delle malattie allergiche

La diagnosi eziologica delle malattie allergiche si basa:
=> sull' anamnesi
=> sui tests "in vivo":

  • con l'esecuzione dei test cutanei quali lo "Skin - Prick test" e i tests di provocazione.

=> Sui tests "in vitro", su sangue.

  • con la ricerca delle IgE specifiche (mediante il Rast Test).

Per riconoscere e quantificare la presenza di IgE specifiche (anticorpi della classe IgE) in un soggetto allergico si utilizza, sia nella ricerca "in Vivo" che in "Vitro", come antigene, l'estratto della sostanza allergizzante che si vuole testare (pollini, acari, alimenti, polveri ecc.).

Nel caso in cui il soggetto è allergico, l'antigene forma con il relativo anticorpo IgE un complesso antigene anticorpo la cui presenza è evidenziata:

  • "in Vivo" da un gonfiore circoscritto (pomfo), pririginoso, circondato da una zona di pelle arrossata
  • "in Vitro" cioè nel siero, dalla formazione di un complesso antigene anticorpo,dal quale è possibile risalire alla quantità di anticorpi IgE specifici presenti nel siero del paziente.

Gli estratti allergenici, finora utilizzati, sono costituiti da una miscela di antigeni e sono in grado, pertanto, di fornire informazioni utili per fare diagnosi di allergia, ma non sono in grado di indicare verso quale componente dell'estratto si è allergici.

Grazie agli sforzi congiunti di ricerca ed industria è stato possibile, negli ultimi anni, isolare, identificare e riprodurre gli antigeni o componenti molecolari contenuti nei diversi estratti allergenici che presentano proprietà strutturali e biochimiche tra loro differenti.
Per esempio: il paziente al quale è stata riscontrata la presenza di IgE specifiche per l'acaro della polvere Dermatophagoides Pteronissinus (Dpt) utilizzando come antigene un estratto allergenico, può essere meglio studiato, sottoponendolo alla ricerca delle IgE specifiche per le tre componenti molecolari Der p1, Der p2, Der p10, utilizzando come antigeni le componenti molecolari ricombinanti rDer p1, rDer p2, rDer p10.
Altro esempio: se il paziente risulta allergico alla betulla si procede alla ricerca delle IgE specifiche per i singoli antigeni o componenti molecolari che sono stati isolati dall'estratto della betulla (Bet v1, Bet v2, Bet v3, Bet v6 ecc.) utilizzando come antigeni quelli ottenuti con tecniche ricombinanti rBet v1, rBet v2, rBet v3, rBet v6 ecc. Gli allergeni molecolari: produzione e prospettive di utilizzo nella diagnostica allergologica (Rassegna)

Antigeni o componenti molecolari ricombinanti(r) e nativi(n)

Negli esempi precedenti si è parlato di allergeni ricombinanti o componenti molecolari. 
Un'allergene ricombinante  è una molecola  che viene riprodotta, mediante l'utilizzo di particolari biotecnologie, dopo essere stata identificata ed isolata da un estratto allergenico.
Gli allergeni ricombinanti, rispetto agli estratti allergenici tradizionali presentano molti vantaggi:
- Sono perfettamente caratterizzati a livello molecolare e immunochimico.
- Sono altamente purificati.
- Sono facili da standardizzare.
- Permettono diagnosi e cure più precise.
Laddove non è stato possibile "riprodurre" gli antigeni ricorrendo a "tecniche ricombinanti" si è ricorso a particolari tecniche estrattive e di purificazione per isolare gli antigeni ai quali è stato dato il nome di nativi (n) per distinguerli dai ricombinanti (r).
In futuro, molti di questi antigeni, ( sia ricombinanti che nativi), oltre ad essere utilizzati ai fini diagnostici, verranno sempre più impiegati ai fini terapeutici nella immunoterapia specifica (ITS) "vaccinazione", per desensibilizzare i soggetti allergici.

MOLECOLE PROTEICHE PRESENTI IN NATURA IN OMOLOGIA CON POLLINI E ALIMENTI

Come già sottolineato, un estratto allergenico, può essere costituito da più componenti molecolari (antigeni) con caratteristiche strutturali e biochimiche tra loro differenti.

Taluni di questi antigeni possono presentare una omologia (somiglianza) strutturale e biochimica, in percentuale variabile, con altre molecole proteiche diffuse nel mondo vegetale e animale che svolgono funzioni di natura diversa: di difesa, enzimatiche, metaboliche, strutturali, di deposito ecc.

Tali proteine sono presenti in pollini (pollini di alberi, di graminacee, di erbe ecc.), in alimenti del regno vegetale (frutta, verdura, semi ecc.), in alimenti del regno animale (latte, uova, carne, molluschi ecc.), in organismi (dermatophagoidi, scarafaggi) in liquidi biologici ecc.

Si è avuto modo di constatare che quando una molecola presenta una alta omologia con altre molecole, da un punto di vista allergologico, il paziente, oltre a poter presentare una sensibilizzazione alla molecola primaria, può essere anche allergico alle molecole omologhe.
Questo ci ha chiarito come mai un soggetto allergico alla polpa della mela spesso risulti allergico al polline della Betulla senza aver mai visto in vita sua una betulla.
In "realtà il paziente potrebbe essere allergico alle proteine PR-10 presenti, in alta omologia, sia nella polpa della mela sia nel polline della Betulla.
In questo caso il paziente potrebbe essere allergico anche a tutti gli altri pollini e alimenti che contengono proteine PR-10. (Lo stato dell'arte della Component Resolved Diagnostic (CRD): cosa sono e a cosa servono i componenti molecolari)

FAMIGLIE DELLE PROTEINE CHE PRESENTANO OMOLOGIA (SOMIGLIANZA) STRUTTURALE E BIOCHIMICA CON ALIMENTI E POLLINI

Classificazioni delle molecole proteiche associate a cibi di origine vegetale

Proteine PR-10

Le proteine PR-10 sono presenti:
=> nel polline della Betulla:molecola Bet v1;
=> in molti alimenti appartenti alle famiglie di Rosacee, Apiacee, Fabacee, Poacee, ecc. (per maggiori dettagli consultare la tabella 1)

Sono proteine labili (termo e gastrolabili) per cui gli alimenti che le contengono, se cotti o, comunque, sottoposti a processi di preparazione (marmellate, succhi di frutta ecc.) sono ben tollerati.
Sono presenti soprattutto nella polpa dei frutti specie della famiglia delle Rosacee (mela, pesca, pera, ciliegia ecc.). Solitamente causano sindromi orali allergici. 

Proteine nsLPTs (non-specific lipid transfer proteins)
Le proteine appartenenti alla famiglia delle nsLTPs (non-specific lipid transfer proteins), giocano un ruolo importante nella difesa delle piante contro funghi e batteri.
Sono proteine che si trovano soprattutto nella buccia della pesca (ne è particolarmente ricca la peluria che ricopre il frutto) e degli altri frutti appartenenti  alla famiglia delle rosacee (mela,pera,pesca,ciliegia ecc.).
Esse sono presenti anche in molti alimenti di origine vegetale appartenenti alla famiglia delle:
Apiacee, Fabacee, Poacee ecc. (per maggiori dettagli consultare la tabella 1)
Sono proteine molto stabili (termo e gastro stabili), pertanto capaci di provocare reazioni sistemiche anche severe come l' anafilassi.
Gli alimenti sbucciati vengono meglio tollerati.

Profiline
Le profiline sono proteine diffusissime in natura e si trovano nel citoplasma di tutte le cellule nucleate.
Il loro nome deriva dalla particolare funzione che esse svolgono, che consiste essenzialmente nel modulare la motilità intrinseca delle cellule, il loro allungamento e quindi la loro forma, in termini più astratti, il loro "profilo".

Sono presenti:
=> nel polline della Betulla:molecola Bet v2;
=> in molti alimenti appartenti alle famiglie di Apiacee, Fabacee, Poacee, Rosacee ecc. (per maggiori dettagli consultare la tabella 1)
Le profiline sono facilmente distrutte dai succhi gastrici ma in genere sono più stabili al calore rispetto alle PR-10.

La sensibilizzazione alla profilina si traduce sul piano clinico nella sindrome orale allergica (SOA), anche se sono state descritte reazioni sospette più severe con il melone, il pomodoro, gli agrumi, il kiwi, la banana e il litchi.

I cibi se cotti, in genere, sono ben tollerati.
Le profiline sono spesso responsabili della polisensibilizzazione ai pollini.

STORAGE PROTEIN (PROTEINE DI DEPOSITO)

Appartengono al gruppo delle proteine di deposito: le 2S Albumine - le vicilin like - Legumin like - thaumatin like protein

- Le 2S Albumine sono piccole proteine globulari, costituite da due sobumità legate da ponti di solfuro (da quì il nome  2S Albumine).

Rappresentano le proteine di deposito dei semi di alcune specie vegetali.
Esse sono molto stabili sia al calore che ai succhi gastrici e rappresentano uno degli allergeni maggiori della noce brasiliana (Bet e1) della noce (Jug r1) dell'anacardio (ana 03) della senape (Sin a1) del sesamo (Ses i1) dell' arachide (Ara h2 - h6 - h7) della mandorla (Pru du 2S albumina ecc.) (per maggiori dettagli consultare la tabella 1).
Sono state segnalate cross reattività tra sesamo e semi di papavero; tra i semi di girasole e senape; tra noce e nocciola.
I pazienti affetti da sensibilizzazioni alle 2S albumine possono manifestare reazioni allergiche sistemiche anche gravi assumendo alimenti appartenenti a questa famiglia di proteine sia cotti che crudi. (per maggiori dettagli consultare la tabella 1)  

- Le vicilin-like e Legumin-like sono proteine di riserva presenti soprattutto nei semi di alcune piante.
Esse, pur svolgendo azioni analoghe, si differenziano per diverso peso molecolare e struttura chimica.

  • Fanno parte della famiglia delle Viciline i seguenti semi o alimenti: Ara h1 (arachide), Cor a11 (nocciola), Jug r2 (noce) , Ana 01 (anacardio), Ses i3 (sesamo), Len c1 (lenticchia), Pis s1 (pisello) ed altri, come da tabella 1.
  • Fanno parte della famiglia delle legumine i seguenti semi o alimenti: Ara h3 (arachide), Cor a9 (nocciola), Jug r4 (noce) , Ana 01 (anacardio), Lup a11S (lupino) ed altri.

Gli alimenti appartenenti a queste due famiglie di Proteine, nei soggetti ad esse sensibilizzati, possono provocare gravi reazioni allergiche, sia se assunti cotti che crudi.

- Le Thaumatin-like protein (TLP) sono molecole appartenenti alla famiglia delle PR-5.
Sono state identificate come allergeni in molti tipi di frutta: Pru p2 (pesca); Mal d2 (mela), Act d2 (kiwi), Pru av2 (ciliegia), Vit v TLP (uva).
nonostante le molecole proteiche delle TLP siano resistenti al calore ed all'azione delle proteasi, i pazienti con tali sensibilizzazioni sembrano presentare solo sindrome orale allergica (SOA).

MOLECOLE PROTEICHE ASSOCIATE A CIBI DI ORIGINE ANIMALE

Proteine del latte bovino

Il paziente allergico al latte bovino può presentare allergia a tutte o ad alcune molecole delle proteine del latte, tra le quali le più rappresentative sono:
Bos d 8 (caseina); Bos d 5 (βeta lattoalbumina);Bos d 4 (α lattoalbumina); Bos d 6 (BSA o Albumina sierica bovina); Bos d lattoferrina (Lattoferrina).

La caseina (Bos d 8)

  • è una delle maggiori componenti del latte vaccino e dei suoi derivati (80% del totale delle proteine del latte).
  • è una molecola che viene degradata dagli enzimi proteolitici mentre è altamente resistente ai processi di pastorizzazione ed ebolizione.
  • è un potenziale allergene nascosto in molti preparati, perchè la caseina ed i caseinati sono utilizzati nell'industria alimentare, come additivi, in salse, zuppe, stufati,condimenti per insalata, glasse per prodotti da forno ecc.
  • chi è allergico alla caseina del latte di mucca può essere allergico alla caseina del latte di capra e di pecora per l'omologia (superiore all' 85%) tra le molecole di caseina del latte di mucca e quello della caseina del latte di capra e pecora.

La βeta lattoglobulina (Bos d 5) è una siero globulina presente nel siero del latte (10% del totale delle proteine del latte).

  • è una proteina relativamente resistente all' idrolasi acida e alle proteasi intestinali. E' resistente alle basse temperature e viene degradata alle alte temperature.
  • Poichè appartiene alla famiglia delle lipocaline alla quale appartengono altri allergeni animali quali: la proteina urinaria maggiore del topo (Mus m1), l'allergene principale del cavallo (Equ c1) e uno degli allergeni della Blatella (Bla g4), il paziente allergico alla βeta lattoglobulina può presentare allergia all' urina del topo, al cavallo, alla blatella germanica.
  • Chi è allergico alla βeta lattoglobulina può assumere yogourt in quanto l' allergenenità della molecola Bos d5 è decisamente inferiore in alcuni derivati del latte acidificato.
  • chi è allergico alla βeta lattoglobulina può essere allergico al latte di renna per la omologia tra le molecole di βeta lattoglobulina presenti nel latte bovino e nel latte di renna.

La α lattoglobulina (Bos d4) è presente nel latte bovino (5%), è la principale proteina del latte materno e rappresenta la principale fonte proteica per il lattante.
E' scarsamente resistente al calore.

La BSA (Bos d6) o albumina sierica bovina rappresenta uno degli allergeni maggiori della carne di manzo ed uno degli allergeni minori del latte vaccino (1%). Essa è labile al calore.

  • Esiste un'alta cross reattività tra BSA del latte vaccino e le albumine ovine, suine, caprine e del cervo, mentre è decisamente più bassa con le albumine di cavallo, coniglio e pollo.
  • Anche le albumine presenti nell'epitelio di cane (Can f3) e gatto (Fel d2) possono reagire con BSA.
  • Pertanto chi è allergico a Bos d6 deve evitare di mangiare le carni crude e deve evitare di tenere cani e gatti in casa.

La lattoferrina (Bos d lattoferrina) è' una glicoproteina legante il ferro, la quale ha un ampio spettro di azioni anti infettive e anti infiammatorie e rappresenta un componente fondamentale delle difese mucosali; per questo è particolarmente concentrato nel colostro.
E' particolarmente termostabile e resistente alla digestione proteica.

Proteine dell'uovo

Le molecole responsabili dell'allergia all'uovo sono: Gal d1 (ovomucoide) - Gal d2 (ovoalbumina) - Gal d3-conalbumina (ovotransferrina) - Gal d4 (lisozima).

L'ovomucoide (Gal d1) è uno degli allergeni maggiori dell'uovo.

  • E' resistente al calore (100°C per 1 ora), alle proteasi digestive e per tali caratteristiche può scatenare reazioni allergiche anche gravi, sia con uovo cotto che crudo, in soggetti ad esso sensibilizzati.

Si è osservato che i pazienti che presentano sensibilizzazione nei confronti di questa molecola proteica sin dai primi anni di vita, potrebbero conservare tale sensibilizzazione per tutta la vita.
La sensibilizzazione può avvenire sia per ingestione che per inalazione o contatto cutaneo.

L' ovoalbumina (Gal d2) è una proteina che sebbene termostabile, sembra perdere gran parte della sua allergenicità dopo trattamento al calore.
E' ben digerita dagli enzimi peptici a ph molto acido (1,5 - 2,5) meno a ph superiore.
Pertanto i soggetti affetti da acloridria gastrica e sensibilizzati all'ovoalbumina possono andare incontro a gravi crisi allergiche se ingeriscono l'uovo crudo.

L'Ovotransferrina (Conalbumina -Gal d3) è una glicoproteina che si può trovare nell' albume, nel tuorlo e nel plasma.
Esiste una parziale cross reattività tra conalbumina e siero albumina di pollo.
Il trattamento al calore diminuisce di molto l'allergenicità.

Il Lisozima (Gal d4) è una piccola molecola la quale resiste al trattamento al calore a 80°C per 2 minuti, anche se a ph più elevati può essere inattivata a temperature più basse.

  • Esso reppresenta un allergene minore dell'uovo, ma, dal momento che viene aggiunto come additivo in alcuni cibi (allergene nascosto) può essere causa di reazioni avverse in soggetti sensibilizzati (può essere causa di sensibilizzazione anche in addetti dell' industria alimentare e farmaceutica dove vengono prodotti (preparati contenenti lisozima).

MOLECOLE RESPONSABILI DELL'ALLERGIA AL PESCE

L'allergene maggiore del pesce è la parvalbumina una molecola facente parte della famiglia delle proteine leganti il calcio ed è contenuta nei muscoli. Vi è un' alta omologia della parvalbumina fra tutti i pesci.

  • E' una proteina termo e gastroresistente, e pertanto responsabile di reazioni sistemiche allergiche anche severe.
  • Le parvalbumina sono:Cyp c1 (carpa); Gad c1 (merluzzo)

Poichè  è stato dimostrato che reagisce con le IgE di oltre il 95% dei soggetti allergici al pesce la parvalbumina purificata della carpa (Cyp p1) è pertanto stata assunta come marcatore di tale allergia.

MOLECOLE RESPONSABILI DI ALLERGIE AI CROSTACEI

  • L'allergia ai crostacei è una delle più comuni allergie alimentari negli adulti ed è spesso associata a reazioni severe.
  • Il maggiore responsabile di tale allergia è la tropomiosina, una molecola stabile al calore ed alla digestione che rappresenta il 20% delle proteine della parte edibile dei crostacei.

Sono tropomiosine le seguenti molecole:

  • Pen a1 (gamberetti); Par s1 (aragosta); Chaf f1 (granchio) (appartenenti alla famiglia degli invertebrati).
  • Tod p1 (calamaro); Tur c1 (lumaca); Cra g1 (ostrica) (appartenenti alla famiglia dei molluschi).
  • Der p10 (dermatophagoides Pt); Per a 7 (scarafaggio); Bla g 9 (scarafaggio germanico).

La tropomiosina può essere considerato un panallergene degli invertebrati con alto grado di omologia e di cross reattività tra le varie specie. CRD nell'allergia alimentare: algoritmi diagnostici

ALLERGIA ALLE PROTEINE DEL LATTICE DELLA GOMMA
(per maggiori dettagli leggere CRD nell'allergia al lattice)

Il lattice della gomma è costituito da una miscela di sostanze che contiene:-

  • il 33% di cis-1,4 poliisoprene di per sè non allergizzante e responsabile delle proprietà fisiche della gomma.
  • il 2% di resina; 65% di H2O ed il 2% di proteine.

Al momento attuale sono state individuate 13 molecole proteiche come allergeni del lattice e sono state denominate Hev b1, Hev b2 ecc. fino a Hev b13 (Hev da Hevea brasilensis:lattice).
Al momento attuale, il soggetto allergico al lattice può essere meglio studiato, sfruttando le informazioni relative alle singole componenti molecolari, anche se non di tutte queste componenti è perfettamente nota la funzione biologica. (vedi tabella 2)

CONCLUSIONE

Lo studio delle allergie, mediante l'utilizzo delle Componenti Molecolari ricombinanti e/o native, come antigeni, nell'esecuzione del RAST, può permettere al medico di adottare ulteriori strategie per la gestione del paziente allergico.
Infatti il paziente, al quale siano state riscontrate IgE specifiche verso un estratto allergenico superiori a 0,1 KU, può essere sottoposto ad ulteriori, più approfondite indagini, mediante l'ulitizzo, come antigene, di Componenti Molecolari ricombinanti e/o native di quell'estratto.
I risultati di queste indagini, come meglio sintetizzato nella tabella 3 potrebbero orientare il Medico:

  • a individuare con maggiore accuratezza i pazienti candidabili a immunoterapia specifica ITS o "Vaccinazione"
  • a suggerire al paziente di evitare l'assunzione di alimenti e/o l'esposizione a sostanze inalanti che presentino cross reattività o reazione crociata.
  • a predire il tipo di reazione allergica ed alimentare a cui è sensibilizzato (reazione lieve come la Sindrome Orale Allergica (SOA) o gravi come lo Shock Anafilattico).

 

Per ulteriori approfondimenti leggi

CRD nell'immunoterapia:algoritmi applicabili nella pratica clinica
CRD nella pratica clinica: casi clinici

 

Dott.ssa Raffaella Di Corato - Medico Chirurgo Specialista in Allergologia e Immunologia Clinica
Dott. Marco Papagni - Chimico Direttore Sanitario del Centro Biomedico Analisi Cliniche;
Dott. Vito Causarano - Medico Chirurgo Specialista in Medicina Interna.

Si ringrazia il Dott. Francesco Laureti della Società Phadia per il prezioso contributo nella supervisione del lavoro.